Русский изменить

Ошибка: нет перевода

×

глава 16

Main page / Генетика XXII века / ГЕНЫ. ДНК. РНК / РНК-трифосфатаза. Гуанилтрансфераза. 5`-5`-трифосфатная связь. 7-метилтрансфераза. m⁷Gppp-РНК. m⁷GpppNp. Кэп. 7-метилгуанозин. CBP20, CBP80. S-Аденозилметионин (SAM). S-Аденозилгомоцистеин (SAH). Цикл SAM. Гомоцистеин. Гипергомоцистеинемия. Гепатопротекторы. Кэп-0, 1, 2, 4. Кэп 2,2,7-триметилгуанозиновый. Самая большая субъединица РНК-полимеразы II — RPB1. CTD, повторы YSPTSPS. Фосфорилирование по Ser-5 и Ser-2. Негативные транскрипционные факторы DSIF и NELF. Нуклеозид DRB. Киназа PTEFb. Внутреннее N⁶-метилирование аденина в мРНК. Кэпсвязывающий комплекс CBC. Тайна экспорта мРНК.

Содержание

    Продолжим знакомиться с основными элементами зрелой матричной РНК. Когда процесс транскрипции только начинается, т.е. когда начинает синтезироваться транскрипт, он начинается, конечно, с какого-то первого нуклеотида. Обычно в качестве первого азотистого основания транскрипта выступает один из пуринов: аденин или гуанин.

    Дальше происходит наращивание цепочки обычным образом: образуется фосфодиэфирная связь между 3`-позицией первого нуклеотида и 5`-позицией второго нуклеозид-монофосфата. Три фосфата мы обозначили буквами альфа, бета и гамма:

    И так продолжается наращивание цепочки мРНК, но параллельно этому кое-что происходит в самом начале растущей мРНК.

    Первый этап:

    Сначала фермент РНК-трифосфатаза отщепляет γ-фосфатную группу от 5`-концевого нуклеотида:

    Второй этап:

    Затем фермент гуанилтрансфераза (ГТаза) присоединяет гуанозин-монофосфат к ставшему крайним β-фосфату 5′-конца транскрипта. Именно гуанозин-монофосфат используется для этой операции, и никакой другой. В результате мы снова получаем три фосфата, которые связывают принесенный гуанозин с 5′-концом транскрипта, и при этом, как видно на рисунке, прицепленный гуанозин прикрепляется не так, как это происходит во время формирования цепочки мРНК, а «вверх ногами», так что образовалась 5`-5`-трифосфатная связь. Важной особенностью этой связи является то, что с ней не умеют справляться эндо- и 5`-3`-экзонуклеазы:

    Образовавшуюся структуру мы записываем так: GpppNp. В этой записи G – это гуанин, ррр – три фосфата, N — любой нуклеозид, с которого начинается транскрипт (чаще всего это аденин или гуанин, но не обязательно), и завершающая р – это фосфат, который связывает первый нуклеозид исходного транскрипта со вторым.

    Отрезание крайнего фосфата и присоединение гуанозин-монофосфата к нуклеозид-дифосфату происходит немедленно после того, как транскрипт стал образовываться, так что если мы проведем анализ имеющихся в клеточном ядре мРНК, то обнаружим исходный нуклеозид-трифосфат без присоединенного к нему гуанозина лишь в следовых количествах.

    Может показаться, что операция по отрезанию γ-фосфата лишена смысла, если сразу вслед за этим снова восстанавливается трифосфат. Может быть можно было бы все упростить: γ-фосфат не отрезать, а вместо гуанилтрансферазы мог бы работать схожий с ней фермент, который просто присоединяет гуанозин к γ-фосфату? Но в таком случае произошла бы катастрофа, потому что гуанилтрансфераза попросту стала бы присоединять гуанозин к любым трифосфатам, которых в клетке очень много (в том числе АТФ, ГТФ и т.д.), и которые выполняют свои важные функции. Именно поэтому существующая технология получается очень эффективной: гуанилтрансфераза может присоединять гуанозин-монофосфат только к такому 5`-концу, на котором находится именно дифосфат, т.е. только к 5′-концу первичного транскрипта, у которого отрезан γ-фосфат.

    Третий этап:

    Теперь фермент 7-метилтрансфераза (или, иначе, N7-метилтрансфераза) прикрепляет метильную группу к 7-му атому гуанина (т.е. к азоту).

    Вообще, если мы рассмотрим «предпочтения» метилтрансфераз, то увидим, что охотнее всего они метилируют атомы азота и кислорода. Атомы углерода выступают в качестве субстрата метилирования существенно реже.

    Метилированный по 7-му атому гуанозин называется 7-метилгуанозин. Обратим внимание на то, что теперь этот метилированный азот получил положительный заряд, ведь он образовал ковалентную связь с углеродом метильной группы по донорно-акцепторному механизму, т.е. предоставил свою 2s-пару электронов для совместного использования, и теперь один электрон из этой пары принадлежит углероду.

    Получившаяся РНК обозначается как m7Gppp-РНК (или m7Gppp-РНК: m7 или m7 означает, что седьмой атом метилирован), а сама структура m7GpppNp получила название «кэп» или «5`-кэп» (произносится как «пять штрих кэп») (точнее – это называется кэп-0, см. ниже).

    Есть и четвертый этап: после того, как 5`-кэп образован, к m7Gppp присоединяются два консервативных белка, образующие кэп-связывающий комплекс (CBCCap Binding Complex): это белки CBP20 и CBP80. Получившийся комплекс из кэп-связывающего комплекса и m7Gppp сохраняется на протяжении всего процесса транскрипции, процессинга (обработки) пре-мРНК и ее последующего транспорта в цитоплазму.

    Можно рассмотреть 3D-модель (т.е. шаро-стержневую модель) 7-метилгуанозина, чтобы получить удовольствие от представления ее трехмерного изображения:

    Всякая матричная РНК эукариот, синтезируемая уже знакомой нам РНК-полимеразой II, обязательно наделяется 5`-кэпом. Если мы в клетке видим кэпированную мРНК, то можем быть уверены, что перед нами именно эукариотическая клетка, потому что мРНК прокариотов кэпов не имеют. Кэпы не просто придают мРНК значительно более высокую стабильность, но и вообще играют разные важнейшие роли в ее функционировании, о чем будет написано чуть ниже.

    Думаю, что всем показалось бы странным, если бы существовал только один способ кэпирования мРНК. Все, что мы уже знаем о клетке, наводит на мысль, что вполне вероятным могло бы быть существование нескольких разновидностей кэпирования. Разные организмы для разных функций могли бы в процессе эволюции выработать немного разные варианты кэпирования и использовать их для различный ситуаций, и так оно на самом деле и случилось, но прежде, чем перейти к рассмотрению этих вариантов, вернемся к третьему этапу создания кэпа – к переносу метильной группы, потому что это очень важный момент в жизни мРНК.

    Чтобы 7-метилтрансфераза, или любой другой фермент, занимающийся переносом метильной группы, мог бы эту группу куда-то перенести, сначала он ведь должен где-то ее взять. Должен иметься некий субстрат, у которого метильную группу можно было бы относительно легко забрать, и таким субстратом является S-Аденозилметионин (кратко: SAM):

    На первый взгляд молекула кажется сложной, но так оно кажется ровно до того момента, как мы увидим, что она представляет собой соединившиеся друг с другом через атом серы метионин и аденозин. SAM стоит того, чтобы его запомнить, потому что он работает как кофермент, предоставляющий свою метильную группу для того, чтобы какая-либо метилтрансфераза перенесла его на выбранный субстрат. Метильная группа, присоединенная к атому серы, в такой молекуле легко отщепляется, что делает SAM очень удобным источником метильных групп, поэтому он и используется в десятках разных метаболических реакций, причем в качестве субстрата могут выступать и нуклеиновые кислоты, и белки, и липиды, поэтому SAM очень часто используется в клетке. Реакции с его использованием идут в очень многих тканях, но производится SAM в основном в печени.

    Любопытным свойством SAM является то, что он легко проникает через гематоэнцефалический барьер (т.е. проникает в мозг через кровь) и обладает умеренным антидепрессивным действием, поскольку стимулирует синтез дофамина. Кроме того, он является гепатопротектором, так как стимулирует регенерацию клеток печени – гепатоцитов.

    Отдавая свою метильную группу, SAM превращается в S-Аденозилгомоцистеин (SAH):

    Таким образом, мы сейчас между делом узнали новую аминокислоту – гомоцистеин. Соответствующее ей трехбуквенное латинское обозначение: Hcy (не путать с НСУ – негативными слепыми уверенностями). Она непротеиногенная (я вынужден это каждый раз добавлять, потому что несмотря на то, что мы выучили все основные протеиногенные аминокислоты, существуют и неосновные, редко встречающиеся в составе белков). Синтез гомоцистеина в организме происходит именно тем путем, какой мы видели выше – путем деметилирования метионина:

    Существует и обратный путь, когда гомоцистеин с помощью витаминов группы В обратно превращается в метионин, поэтому в нашем организме поддерживается нужный баланс этих веществ. Совокупность реакций, в которых SAM образуется, используется с превращением в SAH, а затем вновь регенерируется, называется циклом SAM.

    В некоторых ситуациях SAM может выступать и в качестве донора аминогруппы.

    Если витаминов B в организме недостаточно, то возникает чрезмерное повышение уровня гомоцистеина — гипергомоцистеинемия. Этим расстройством в основном страдают курильщики, а также кофезависимые люди, выпивающие несколько чашек кофе в день. Физическая активность способствует снижению повышенного уровня гомоцистеина. Любопытно, что небольшие дозы алкоголя снижают уровень гомоцистеина ближе к нормальному, а большие дозы, наоборот, повышают его. Вообще гипергомоцистеинемия – весьма неприятная штука, так как гомоцистеин, находясь в организме в избыточном количестве, начинает изъязвлять внутренние стенки артерий, разрушая артериальный эндотелий, провоцируя образование тромбов и атеросклеротических бляшек. Повышенный уровень гомоцистеина увеличивает риск возникновения болезни Альцгеймера и старческого слабоумия.

    И вот теперь на этой радужной ноте можно перейти к изучению разных вариантов кэпирования:)

    Описанный выше вариант кэпирования является самым простым. Он встречается у всех эукариот, хотя и не слишком часто, а у животных — и вовсе редко, и такой самый простой вариант кэпа, представляющий собою 7-метилгуанозин, соединённый 5′,5′-трифосфатным мостиком с первым нуклеозидом исходного транскрипта, называется кэп-0.

    Чаще всего построение кэпа на этом не заканчивается и происходит добавление еще одной метильной группы — к 2`-кислороду рибозы первого нуклеозида изначального, немодифицированного транскрипта (т.е. того нуклеозида, который сейчас, после добавления кэпа, стал вторым по счету). Такой кэп с двумя метильными группами — m7GpppNm2′-Op – это кэп-1 (m₂’₋₀ означает метилирование 2`-атома рибозы, кислорода):

    Естественно, метильная группа не может сама присоединиться к 2`-кислороду рибозы, и тут нужен специальный фермент, который катализирует реакцию такого метилирования, и который так и называется: 2`-О-метилтрансфераза.

    Именно кэп-1 и является преобладающим вариантом кэпирования у всех эукариот (за исключением одноклеточных, которые предпочитают более простой кэп-0).

    Существует разновидность кэпа-1, которая реализуется лишь иногда, да и то лишь в том случае, если первым нуклеозидом изначального транскрипта является аденин: в положение N6 добавляется еще одна метильная группа, причем фермент, который выполняет эту процедуру, добавит метильную группу в положение N6 только в том случае, если аденозин уже метилирован в положении 2`-О:

    Примерно в 10-15% случаев встречается кэп-2: в этом случае метилированию подвергается еще и второй нуклеозид изначального транскрипта, причем это всегда только 2`-О-метилирование рибозы. Формула кэпа-2 выглядит громоздко, но все-же это отчасти искупается ее информативностью: m7GpppNm2′-OpNm2′-Op. Можно ее упростить до m7Gppp(Nm2′-Op)1,2

    Итак, подытожим, что у животных встречаются в основном кэп-2, 10-15% кэп-1 и изредка кэп-0. Точное их соотношение варьирует от вида к виду. Легко создать мнемоническое правило: если ни один нуклеозид исходного транскрипта не метилируется, то это кэп-0. Если метилирован только первый нуклеозид исходного транскрипта, то это кэп-1, а если первый и второй – кэп-2.

    Некоторые простейшие эукариоты, например инфузории, в процессе своей эволюции пришли к кэпу-4, в котором 2`-О-метилирование рибозы производится аж на четырех первых нуклеозидах изначального транскрипта: m7Gppp(Nm2′-Op)1-4.

    Кэпирование – это не абсолютная монополия мРНК, и малые ядерные РНК тоже ему подвергаются, но, что вполне логично, их кэпирование заметно отличается от того, которому подвергаются мРНК: у них имеется 2,2,7-триметилгуанозиновый кэп (m2,2,7GpppNp), т.е. гуанин несет три метильные группы, а нуклеозиды изначального транскрипта метилированию не подвергаются, так что можно считать это вариантом кэпа-0:

    Мнемоническое правило: кэп-0 мРНК имеет только один метил, а кэп-0 мяРНК — три, потому что в название РНК добавляется буква “я” с двумя метиловыми ножками:

    Для того, чтобы вышеупомянутые ферменты могли осуществить процесс кэпирования, они должны каким-то образом занять правильную позицию, т.е. им нужна какая-то основа, к которой они прикрепятся, при этом оказавшись именно в нужном месте и именно в нужном положении, чтобы суметь эффективно выполнить свою работу. Неудивительно, что именно тот белковый комплекс, который занимается производством мРНК, т.е. РНК-полимераза (у эукариот это состоящая из 12 субъединиц РНК-полимераза II), и предоставляет этим ферментам нужную посадочную площадку.

    Двенадцать субъединиц РНК-полимеразы II обозначаются как RPB1… RPB12. Самая большая из них — это RPB1, и именно она играет ключевую роль в позиционировании ферментов для кэпирования. Дело в том, что ее концевой С-домен имеет уникальную, и, соответственно, легкораспознаваемую структуру — он состоит примерно из 25-50 гептапептидных повторов (в зависимости от вида животного): Tyr-Ser-Pro-Thr-Ser-Pro-Ser (или, короче, YSPTSPS). Мнемоническое правило: «YeS, PeTS need a PaSs [to their sitting place]».

    Пять субъединиц являются общими для РНК-полимераз всех трех типов, а самые крупные их субъединицы в высокой степени гомологичны (схожи), но только у РНК-полимеразы II на С-конце имеется этот концевой домен с гептапептидами. Если в клетках удалить хотя бы половину этих повторов, то организм не сможет выжить.

    Но конечно, если бы ферменты, занимающиеся кэпированием, прицеплялись бы к концевому С-домену RPB1, то они всегда бы там и висели безо всякого смысла, поэтому такого конечно не происходит: кэпирующие ферменты присоединятся к этому домену только тогда, когда и если он будет фосфорилирован, и фосфорилируется он в тот момент, когда РНК-полимераза II садится на свое место на цепи ДНК и начинает создавать мРНК. Именно к фосфорилированному концевому С-домену РНК-полимеразы II и присоединяются ферменты, которые занимаются кэпированием пре-мРНК.

    Как мы знаем, фосфорилированием белков занимаются протеинкиназы, и сразу несколько протеинкиназ могут фосфорилировать аминокислотные остатки С-концевого домена субъединицы RPB1, чтобы подготовить этот С-конец для посадки кэпирующих ферментов. Посмотрим, как именно и в каком порядке это происходит.

    Рассмотрим тот момент, когда произошла инициация транскрипции, т.е. РНК-полимераза II начала строить пре-мРНК. Сразу после этого протеинкиназы начинают фосфорилировать Ser-5 – это те серины (точнее – аминокислотные остатки серина), которые находятся на пятой позиции в тех самых эволюционно консервативных последовательностях концевого С-домена большой субъединицы — YSPTSPS. Дальше происходит очень любопытная вещь. Мы должны учесть, что РНК-полимераза II работает с поистине фантастической скоростью – она может катализировать несколько миллионов реакций в секунду! Так что мы можем понять, что пре-мРНК строится очень быстро, но мы же помним, что прежде, чем пре-мРНК достигнет значимых размеров, она должна быть кэпирована, в противном случае ее могут ждать неприятности в виде ферментов, которые занимаются утилизацией бесхозных РНК — например, это могут быть экзосомы или разные экзонуклеазы – белки, отщепляющие концевые нуклеозид-монофосфаты. Значит постройка пре-мРНК должна быть приостановлена до тех пор, пока не завершится кэпирование. Так и происходит, и в дело вступают два белка, которые занимаются этой работой – они успевают так оперативно приостановить удлинение мРНК, что РНК-полимераза II успевает синтезировать лишь 20-60 мономеров.

    Как только началось фосфорилирование РНК-полимеразы II по Ser-5, к ней присоединяется негативный транскрипционный фактор DSIF (DRB sensitivity inducing factor). DSIF делает простую вещь: он вставляет в растущую цепочку совершенно нетипичный для мРНК нуклеозид, который имеет название DRB, после чего эта цепочка просто не может достраиваться дальше. С одним нетипичным нуклеозидом – псевдоуридином — мы уже сталкивались раньше, но в отличие от него DRB более существенно отличается от привычных нам нуклеозидов. Интересно, что в его состав входят два атома хлора, которые настолько нетипичны для нуклеозидов РНК, что РНК-полимераза II в изумлении останавливается и замирает:). Впрочем, я не думаю, что запоминание формулы DRB окажется сколь-нибудь затруднительным, так как он похож на лягушку с хлорными лапами и азотными глазами. Мнемоническое правило для запоминания «DRB» — «Цепочка мРНК разДРоБлена хлорной ДРоБиной»:

    Однако, одного DSIF оказывается недостаточно для того, чтобы постройка мРНК надежно остановилась, поэтому как только он уселся на свое место в РНК-полимеразе II, он тут же привлекает второй негативный транскрипционный фактор: NELF (negative elongation factor). И вот теперь вдвоем они надежно останавливают на нужное время элонгацию (т.е. удлинение) цепочки мРНК, и есть время для проведения кэпирования. Скажем лишь пару слов про этого напарника DSIF. NELF берет цепочку из первых нескольких десятков синтезированных мономеров и попросту отодвигает ее от активного каталитического центра РНК-полимеразы II, так что мало того, что в цепочку вставлен DRB, так к тому же РНК-полимераза II просто физически не может теперь достраивать мРНК. Мнемоническое правило для NELF: «НЕЛьзя удлинять мРНК».

    Таким образом, мы видим одну цепь событий, берущих свое начало с момента, когда начинается фосфорилирование РНК-полимеразы II по Ser-5. Но у этого фосфорилирования есть и другие последствия. Теперь, когда пора приступать к созданию кэпа, нужно, чтобы свою работу выполнили соответствующие ферменты, и как раз так получается, что гуанилтрансфераза имеет сродство именно к такому С-концевому домену большой субъединицы РНК-полимеразы II, в котором повторы YSPTSPS фосфорилированы по Ser-5. Так и получается, что параллельно с приостановкой наращивания цепочки мРНК происходит прикрепление гуанозин-монофосфата к β-фосфату 5′-конца транскрипта.

    Итак, фосфорилирование YSPTSPS по Ser-5 влечет за собой:

    а) присоединение DSIF и NELF; транскрипция приостановлена;

    б) присоединение гуанилтрансферазы, постройка кэпа.

    Этот процесс исключительно точно синхронизирован, чтобы ферменты не работали вразнобой, и эта синхронизация достигается еще и тем, что гуанилтрансфераза связывается не только с Ser-5-фосфорилированным YSPTSPS, но одновременно еще и с одной из субъединиц фактора DSIF! Так что пока DSIF не встал на свое место, гуанилтрансфераза не может выполнить прикрепление гуанозин-монофосфата. Напоминает работу часового механизма, где каждая деталь встает на свое место ровно в нужный момент и в точно определенном сочетании с другими деталями.

    В этом описании конечно опущено множество мелких деталей, и теперь мы переходим к завершающему моменту: кэп построен, пора запускать процесс элонгации, а значит пора убирать со своих мест DSIF и NELF. Эта работу проводит киназа PTEFb (positive transcription elongation factor b). Как мы знаем, киназы занимаются фосфорилированием, и PTEFb фосфорилирует сразу и DSIF, и РНК-полимеразу II. Это приводит к тому, что DSIF, а вслед за ним и NELF отваливаются в сторону и идут работать в другом месте, а элонгация запускается на полную мощь:

    После того, как элонгация запущена, происходит еще один важный этап: фосфорилирование переносится с Ser-5 на Ser-2, что играет роль своего рода окончательной печати, указывающей на то, что пре-мРНК должным образом кэпирована, и что эта тема для данной пре-мРНК успешно закрыта. К тому моменту, когда транскрипт насчитывает уже около 500 мономеров, в С-концевой части RPB1 уже не найти фосфорилированного Ser-5, и все участвовавшие в кэпировании ферменты уже ушли к другим строящимся пре-мРНК.

    Есть один момент, который не относится напрямую к теме кэпирования, но все же имеет к ней косвенное отношение. По неизвестным причинам в мРНК высших эукариот время от времени (примерно один раз на 1000-2000 мономеров) происходит N6-метилирование аденина, так что в мРНК, типичной для них, можно иногда встретить один или два N6-метиладенина, но их может и не быть. Смысл этого явления неизвестен.

    Мы уже рассматривали явление сплайсинга, в результате которого одни и те же пре-мРНК могут быть по-разному нарезаны и скомпонованы, так что в итоге с одного гена можно получить несколько разных белков в процессе трансляции. Оказывается, кэп оказывает влияние на этот процесс сплайсинга, потому что после того, как кэпирование завершено и элонгация пре-мРНК началась, с кэпом, как мы уже знаем, связывается кэпсвязывающий комплекс CBC. Когда приходит время и пре-мРНК полностью синтезирована, она выходит в большую взрослую жизнь и сталкивается с одним из компонентов будущей сплайсосомы. Этот компонент связывается с СВС, в результате чего получает возможность приземлиться на пре-мРНК недалеко от 5`-конца, вслед за чем к нему начинают присоединяться другие компоненты сплайсосомы, и когда сплайсосома окончательно сформируется, она начинает свою работу. У разных простых организмов существуют свои способы активации сплайсосомы и без участия кэпа.

    Теперь нанесем все эти этапы кэпирования на одну схему, чтобы иметь возможность целиком окинуть их взглядом:

    Вообще, чем больше мы изучаем кэп, тем больше понимаем, насколько важную роль он играет в процессе изготовления зрелой мРНК. Такое впечатление, что он пролез буквально в каждую щель:) Оказывается, что тот же самый СВС играет важную роль в процессе полиаденилирования. Именно СВС связывается с белковым комплексом, который отщепляет 3`-конец перед тем, как там начнется создание поли(А)-хвоста.

    Ну и уже совершенно ясно, что кэп играет очень важную роль в процессах транспортировки готовых мРНК из ядра, ведь именно он играет главную роль сертификата качества мРНК, именно он и сообщает другим клеточным механизмам, что перед ними именно мРНК. Транспортировкой мРНК за пределы клеточного ядра занимается группа специализированных белков, которые связываются с мРНК опять-таки с помощью СВС. Соответственно транспортный комплекс прикрепляется к мРНК не в случайном месте, а там, где находится СВС, т.е. очень близко к ее 5′-концу, поэтому и тащит он ее именно 5′-концом в сторону клеточной цитоплазмы, т.е., как ни смешно, «головой вперед»:)

    То же самое происходит и с малыми ядерными РНК, которые, как было написано выше, тоже кэпируются. С ними все немного сложнее, потому что если мРНК полностью созревают в ядре и выходят в цитоплазму для того, чтобы работать, то мяРНК не могут полностью созреть в ядре, хотя и предназначены работать именно там. Поэтому сначала их экспортируют за пределы ядра в цитозоль, где они окончательно созревают, после чего их снова тащат обратно в ядро, и при движении в обоих направлениях кэп играет свою важную роль.

    С перемещением мРНК из ядра связано очень загадочное явление: когда она отбуксирована к ядерной поре, она в течение нескольких секунд зависает и парит над порой, словно дайвер, добившийся нейтральной плавучести. В течение этих секунд над мРНК производится еще некоторая работа по «заворачиванию» ее в белки, после чего она практически мгновенно – за десятки миллисекунд — проникает через ядерную пору наружу, в клеточную цитозоль. Удивительно тут то, что некоторые комплексы, состоящие из мРНК и ассоциированных с нею белков, имеют очень большие размеры, и как так получается, что они выходят из ядра так мгновенно, да еще через намного более узкую пору… это пока что остается тайной.

    Кэп играет важную роль и в процессе трансляции – постройки белка по мРНК, но это мы будем изучать позже.