Русский изменить

Ошибка: нет перевода

×

глава 14

Main page / Генетика XXII века / ГЕНЫ. ДНК. РНК / Транспортные РНК. Антикодон. Аминоацил-тРНК-синтаза (АРСаза). Аминоацил-тРНК. Петли тРНК: D, T, дополнительная, антикодоновая. Хвост А-Ц-Ц. Шесть стадий производства тРНК. Экспортин t. Псевдоуридин (ψ). ψ-синтаза. Аденозинмонофосфат (АМФ) (адениловая кислота). Аминоацил-аденилат. Пирофосфат (PPi). Претрансферное редактирование аминоацил-аденилата. Посттрансферное редактирование аминоацил-тРНК. Пирролизин. Эпитранскриптомика. m¹А, m⁶А. Кетоны. Химическая номенклатура. Номенклатура альдегидов.

Содержание

    Итак, таблица генетического кода показывает нам, что триплеты в кодирующей области мРНК кодируют те или иные аминокислоты. Некоторому триплету соответствует совершенно определенная аминокислота, только эта и никакая другая, которая и будет поставлена рибосомой на свое место в строящемся белке. Как физически происходит этот процесс? Как именно происходит процесс подбора нужной аминокислоты для нужной позиции в белке?

    Здесь мы подходим к очередному действующему в процессе трансляции лицу, точнее – к лицам:) Нам понадобится транспортная РНК (тРНК), и мы сначала в самых общих чертах узнаем – что это такое и как она работает, после чего начнем уточнять разные детали.

    Как понятно из названия, тРНК — это именно РНК. На рисунке мы видим ее трехмерное изображение, а также ее примерную схему – как она выглядит, если ее расправить и разложить на плоскости (получается конфигурация клеверного листа):

    Задача тРНК состоит в том, чтобы транспортировать аминокислоту к рибосоме, непосредственно к месту синтеза белка, при этом очень важно то, что каждой из 20 главных протеиногенных аминокислот соответствует своя тРНК. Значит, должно быть как минимум 20 видов тРНК (на самом деле больше, потому что некоторые аминокислоты имеют более одной соответствующей им тРНК).

    Для того, чтобы тРНК смогла доставить куда-то аминокислоту, сначала она должна с ней ковалентно связаться, поэтому аминокислота прикрепляется к 3`-концу тРНК:

    Когда мы исследовали структуру РНК, то видели, что цепочка из мономеров строится таким образом, что каждый фосфат мономера связывается с гидроксилом предыдущего мономера, причем именно с тем гидроксилом, который прикреплен к третьему атому рибозы. Этот гидроксил мы и называем 3`-концом готовой цепочки РНК:

    Но все это относится только к построению нуклеиновых кислот, а мы сейчас рассматриваем присоединение аминокислоты к тРНК, и в ситуации, когда аминокислота присоединяется к 3`-концу тРНК, она может присоединиться к любому из гидроксилов рибозы последнего мономера, и если она присоединится к тому из них, который прицеплен ко второму атому рибозы, то соответственно мы и скажем, что аминокислота прикрепилась к 2`-концу тРНК. Для простоты я буду дальше писать «присоединена к 3`-концу» вместо громоздкого «присоединена к 3`- или 2`-концу», так что запись «3`-конец» просто будет обозначать конец, противоположный 5`-концу.

    Если тРНК загружена аминокислотой, ее называют аминоацил-тРНК.

    Мы видим, что на противоположном к 3′-5′ концу тРНК имеется триплет азотистых оснований, который называется антикодоном. Когда рибосома берет в обработку некоторый кодон на мРНК, она создает условия, при которых аминоацил-тРНК (т.е. тРНК, несущая на себе аминокислоту) может притянуться к этому месту. Но не всякая аминоацил-тРНК будет принята, а только та, чей антикодон будет комплементарен кодону. Именно такая аминоацил-тРНК будет иметь в своем составе ту аминокислоту, которая нужна в данном месте строящегося белка. Далее кодон мРНК и антикодон аминоацил-тРНК спариваются, образуя друг с другом три водородные связи (каждая пара азотистых оснований образует одну водородную связь), так что в целом связь оказывается достаточно прочной (на самом деле, в области антикодона у тРНК имеется сильный изгиб, т.к. это самый крутой участок петли, и с этим связаны важные особенности процесса спаривания кодона с антикодоном, которые мы рассмотрим не здесь).

     

    Рибосома отсоединяет полипептидную цепь, готовую к данному моменту, от предыдущей тРНК и пересаживает её на аминокислоту, принесенную только что присоединившейся тРНК. Это приводит к тому, что предыдущая тРНК освобождается от своего груза, становится пустой и свободной и вновь уходит в свободное плавание в поисках своей новой аминокислоты, и теперь полипептидная цепь целиком становится привязанной к новой тРНК, удлинившись, таким образом, на одно звено, и этот процесс повторяется снова и снова: снова приходит следующая аминоацил-тРНК, антикодон которой комплементарен следующему кодону мРНК, растущая полипептидная цепь пересаживается теперь на нее, и так этот процесс и идет дальше и дальше с невероятной скоростью: около 1000 присоединенных аминокислотных остатков в секунду.

    Когда аминокислота присоединяется к тРНК, она делает это своей карбоксильной группой, а сам процесс ковалентного присоединения аминокислоты к 3`-концу тРНК осуществляет фермент аминоацил-тРНК-синтаза (иногда пишут не «синтаза», а «синтетаза», а короткая форма — АРСаза), причем снова для каждой разновидности тРНК нужна своя АРСаза.

    Для обозначения разных аминоацил-тРНК пишут в виде префикса три латинских буквы, обозначающих эту аминокислоту, например Ala-тРНК и т.д.

    Для того, чтобы обозначить именно ту тРНК, которая переносит конкретную аминокислоту, мы используем верхний индекс и пишем так: тРНКn, где вместо «n» пишем трехбуквенное обозначение этой аминокислоты.

    Если одну и ту же аминокислоту могут переносить несколько тРНК, то мы их обозначаем так: тРНК1n , тРНК2n и т.д.

    Хотя первичная структура всех тРНК различна, и каждой тРНК соответствует своя определенная последовательность азотистых оснований, тем не менее вторичная структура (клевер) и третичная (объемная) у них одинаковы, поэтому любая аминоацил-тРНК может встать в одну и ту же нишу в рибосоме и отдать там свою аминокислоту, а потом каждая тРНК выходит из рибосомы также одним и тем же путем. Для того, чтобы с помощью рибосомы образовалась пептидная связь между уже построенным полипептидом и принесенным новым аминокислотным остатком, затрачивается энергия химической связи между принесенным аминокислотным остатком и тРНК.

    Можно упрощенно представлять это так, что аминокислотный остаток присоединен к тРНК своего рода «химической пружинкой», которая стремится распрямиться и отдать свою энергию, и рибосомные РНК, которые и проводят весь этот каталитический процесс присоединения готовой полипептидной цепочки к вновь принесенному аминокислотному остатку, и играют роль того спускового механизма, который позволяет химической энергии высвободиться таким образом, что образуется полипептидная связь.

    Так и получается, что выбор того, какая именно аминокислота будет вставлена в данное место белка, определяется именно тем, какая аминоацил-тРНК присоединится к мРНК в результате опознания кодона антикодоном. Сама по себе аминокислота, несомая тРНК, никакого влияния на этот процесс не оказывает, что доказывается простым экспериментом: если поймать какую-нибудь аминоацил-тРНК, заменить её аминокислоту на любую другую и выпустить её на свободу, то именно эта новая аминокислота и будет вставлена на то место, где должна была бы стоять аминокислота, которую тРНК изначально несла.

    Этот эксперимент показан на рисунке. Берем цистеин, отрываем от него тиольную группу -SH, углерод подцепляет из окружающей его водной среды недостающий ему водород, и мы получаем аланин, и та же тРНК тащит на себе к рибосоме уже не цистеин, а аланин. Это не оказывает никакого влияния на узнавание кодона антикодоном, и вместо цистеина в растущий белок вставляется аланин.

    Мы видим в структуре тРНК три шпильки с петлями (иногда их называют плечами тРНК). Эти шпильки ориентированы условно на восток, запад и юг. Между «южной» и «восточной» шпильками имеется еще одна петля, которая чаще всего бывает маленькой, но может быть и самой большой, как на рисунке ниже. Каждая из этих петель имеет свое название, чтобы нам легче было о них говорить:

    В той ориентации рисунка с изображением вторичной структуры тРНК, который мы используем, левая петля называется D–петлей, нижняя — антикодоновая, правая – Т-петля, плюс дополнительная петля, длина которой, как мы видим, может меняться в широком диапазоне: от очень маленькой (самая маленькая содержит лишь 3 основания) до очень большой (самая большая содержит 21 основание).

    Т-плечо часто обозначается довольно неудобоваримым образом: ТψС-плечо, (буква греческого алфавита «ψ» произносится как «пси»). Дело в том, что в состав этого плеча входит модифицированный нуклеозид псевдоуридин, который и обозначается буквой ψ.

    Важно отметить, что 3`-конец тРНК всегда оканчивается хвостом из трех оснований: А-Ц-Ц.

    Если не учитывать вариабельность дополнительной петли, то можно сказать, что практически все тРНК очень консервативны в длине своей структуры и чаще всего содержат 76 оснований, хотя бывают и другие варианты, поскольку D-плечо тоже обладает некоторой изменчивостью.

    Интересно, что когда тРНК только производится в клетке, то конечно, она содержит только обычные четыре азотистых основания, иначе и не может получиться в процессе транскрипции. Но в результате последующей обработки получается так, что некоторые азотистые основания подвергаются модификации, так что в итоге тРНК в своем составе имеют несколько модифицированных азотистых оснований. Всего таких необычных азотистых оснований в составе разных тРНК найдено более 50! Всего же в состав разных РНК входят более 100 разных модифицированных азотистых оснований. Так что тут большой простор для запоминания формул:)

    Таким образом мы сейчас можем представить все шесть стадий производства тРНК в той последовательности, в которой они происходят:

    1. РНК-полимераза III (не II, а именно III) осуществляет транскрипцию и производит транскрипт в виде пре-тРНК
    2. удаляется 5′-последовательность (лидерная)
    3. удаляется 3′-последовательность (концевая)
    4. к 3′-концу пришивается последовательность А-Ц-Ц
    5. вырезаются интроны (у эукариот и архей)
    6. производится модификация некоторых азотистых оснований.

    После того, как готовы зрелые тРНК, их надо перенести из ядра в цитоплазму клетки, и они будут готовы к работе. Белок, который экспортирует тРНК в цитоплазму, предсказуемо называется экспортином t.

    L-образная третичная структура зрелой и готовой к работе тРНК возникает из-за того, что некоторые основания, остающиеся неспаренными во вторичной структуре тРНК, образуют друг с другом водородные связи, т.е. спариваются.

    Раз уж мы упомянули псевдоуридин, то заодно и выучим его формулу, тем более что это самый часто встречающийся модифицированный нуклеозид, да и выучить его формулу будет очень легко:

    Модификацию уридина в псевдоуридин производит фермент с понятным названием ψ-синтаза (пси-синтаза или псевдоуридин-синтаза). Глядя на рисунок, легко понять – что именно делает ψ-синтаза: она отрывает урацил от рибозы, переворачивает его вдоль оси 3-6 и прикрепляет обратно к рибозе. Таким образом, псевдоуридин и уридин содержат оно и то же азотистое основание – урацил, просто он иначе прикреплен к сахару. Так что, когда мы говорим о модификации мономеров РНК, нам надо иметь в виду, что не всегда это происходит путем модификации азотистого основания — оно-то может оставаться и неизменным, а модификации при этом подвергается нуклеозид в целом. Тут важно отметить, что в результате такой операции мы не просто получаем другой нуклеозид, но у этого нового нуклеозида исчезла гликозидная связь, связывавшая урацил и сахар. Теперь на этом месте находится обычная ковалентная связь между двумя углеродами, которая по своим свойствам сильно отличается от гликозидной: гликозидная связь, как и пептидная, заметно прочнее обычной ковалентной, и ее тоже можно считать, как и пептидную, «частично двойной».

    Остается вопрос: а каким образом получается так, что именно цистеиновая АРСаза ловит именно цистеиновую тРНК и цепляет к ней цистеин? Чтобы разобраться в этом вопросе, надо внимательно рассмотреть весь этот процесс.

    1. В самом начале АРСаза в одном из своих активных центров связывает нужную ей аминокислоту и молекулу АТФ. Вслед за этим две крайние фосфатные группы отщепляются, и оставшийся аденозинмонофосфат (АМФ) (моно – «один», «монофосфат» — одна фосфатная группа) соединяется с аминокислотой. Такая молекула имеет свое название — аминоацил-аденилат (пишут и с дефисом, и без). Синонимичное название – аминоацил-АМФ. Отцепившийся от АТФ сегмент, состоящий из двух фосфатных групп, в котором два атома фосфора соединены атомом кислорода, называется пирофосфатом: P2O74− (он обозначается как «PPi», от англ. pyrophosphate inorganic — «пирофосфат неорганический»).

    Если мы хорошо представляем себе, как выглядит АТФ, то и АМФ представить очень легко. Часто используется другое название АМФ – адениловая кислота:

    Выполнение работы по изготовлению аминоацил-аденилата сопряжено с решением довольно непростой проблемы: как отличить именно нужную аминокислоту от других? Это ведь совсем непросто. Другое дело – выбрать нужную тРНК, ведь тРНК – это очень большие молекулы, они заметно отличаются друг от друга и своим составом, и главное – своим антикодоном. Конечно, у белка АРСазы нет кодонов и антикодонов – это ведь белок, а не нуклеиновая кислота, но все же кодон тРНК – это достаточно крупный кусок молекулы, который должен суметь абсолютно точно встать в нужную нишу на АРСазе, чтобы точно совпало и расположение атомов, и чтобы распределение электрических полей вокруг них имело нужную конфигурацию. А вот с аминокислотами все сложнее, особенно при том, что многие аминокислоты еще и очень похожи друг на друга. Например, некоторые из них отличаются друг от друга лишь одной метильной группой (изолейцин и валин, аланин и глицин):

    Эта проблема решается в целом таким же образом – нужная аминокислота должна очень точно попасть в соответствующий карман АРСазы, и если даже лишь три атома (метильной группы) стоят не совсем там, где надо (у лейцина и изолейцина), то эта аминокислота не сможет встать в правильном положении в активном центре АРСазы. Ошибки, тем не менее, случаются, правда очень редко – в среднем в одном случае из пятидесяти тысяч (!) АРСаза берет в работу не ту аминокислоту, но и это нестрашно.

    Во-первых, у самой АРСазы есть свои внутренние системы контроля за ошибками, и если ошибка найдена на этой стадии, то происходит редактирование: аминоацил-аденилат расщепляется прямо там же, в том же активном центре, в котором он был собран, в соседней нише. Такое редактирование называется претрансферным, так как оно происходит еще до того, как АРСаза катализировала реакцию аминоацил-аденилата с тРНК, т.е. еще до того, как аминокислотный остаток был перенесен на тРНК и связан с ней. Например, лейцин не помещается в сайт синтеза у изолейцин-синтазы, потому что у него боковая цепь торчит в сторону так, что он занимает в итоге чуть больший объем по сравнению с изолейцином, и в результате образовавшийся неправильный аминоацил-аденилат не может легко пройти дальше по конвейеру и присоединиться к тРНК, и поэтому расщепляется.

    В некоторых ситуациях при претрансферном редактировании АРСаза попросту выпихивает из себя неправильно образованный аминоацил-аденилат, и поскольку в таком свободном состоянии он нестабилен, то затем и расщепляется (гидролизуется) самостоятельно без участия каких-либо ферментов, т.е. происходит его неферментативный гидролиз в цитозоле.

    Но если ошибочный аминокислотный остаток уже соединился с тРНК, то и это не страшно, так как АРСаза умеет выполнять и посттрансферное редактирование, расщепляя уже готовую аминоацил-тРНК: 3’-конец тРНК с присоединенным к нему неправильным аминокислотным остатком перемещается в другой активный центр АРСазы, где и происходит расщепление, после чего и аминокислота, и тРНК выпускаются обратно в свободное плавание:

    Несмотря на такой двойной контроль, существуют еще и свободно плавающие ферменты, которые, обнаружив в цитозоле неправильно сконструированные аминоацил-тРНК, также расщепляют их.

    Здесь есть еще один интересный момент. Как мы только что увидели, АРСаза перед тем, как соединить аминокислоту и тРНК, сначала снабжает аминокислоту аденозинмонофосфатом, делая из нее аминоацил-аденилат.

    Для чего нужен этот АМФ? Ответ очевиден: для того, чтобы обеспечить энергией процесс переноса этого аминокислотного остатка на тРНК, ведь откуда-то должна браться энергия на создание этой связи? Когда АРСаза соединяет аминокислотный остаток с тРНК, она должна ведь совершить работу, т.к. это энергозатратный процесс (в противном случае аминокислоты и тРНК хаотично спаривались бы в цитозоле), и где же ей взять столько энергии? Это надо к ней подводить целую трубу, снабжающую ее энергией непрерывным потоком… Но надобности в трубе или в линии высоковольтной передачи нет, так как имеются мини-аккумуляторы в виде АМФ.

    Первый этап рассмотрели, теперь посмотрим на следующий этап работы АРСазы.

    2. Аминоацил-аденилат – нестабильная молекула, и если он выйдет из активного центра АРСазы и попадет в окружение молекул воды, то сразу же распадется — связь между АМФ и аминокислотным остатком будет тут же гидролизована. Поэтому сразу после того, как образовался аминоацил-аденилат, с ним связывается 3`-конец тРНК, после чего и происходит перенос аминокислотного остатка на 2`- либо 3`-ОН группу рибозы, входящей в состав последнего на 3`-конце аденина тРНК.

    Итак:
    *) аминокислота + АТФ => аминоацил-АМФ + PPi
    *) аминоацил-AМФ + тРНК => аминоацил-тРНК + АМФ
    Суммарно: аминокислота + тРНК + АТФ => аминоацил-тРНК + АМФ + PPi

    Подытожим и информацию об устройстве АРСазы: у нее есть два основных домена. Первый – это аминоацилирующий домен, в котором происходят описанные выше процессы. Второй – антикодонсвязывающий домен, в котором происходит узнавание последовательности антикодона тРНК.

    ………………………….……………………………..………………………

    Общая схема работы АРСазы и аминоацил-тРНК изображена на рисунке:

    Мы помним, что кроме основных 20 протеиногенных аминокислот есть и другие, в число которых входят селеноцистеин и пирролизин. Они называются нестандартными, потому что в таблице генетического кода нет таких кодонов, которые бы соответствовали только им. В каком-то смысле стоп-кодон UGA можно рассматривать, как соответствующий селеноцистеину, это мы уже рассматривали, а стоп-кодон UAG может кодировать пирролизин (у этой парочки нестандартных аминокислот последние буквы соответствующих им стоп-кодонов меняются местами).

    UGA — селеноцистеин (фи-GAсе как неожиданно используется стоп-кодон)
    UAG — пирролизин

    Однако между этими двумя аминокислотами есть существенная разница в том способе, с помощью которого они попадают в состав белков: у пирролизина есть своя АРСаза, а у селеноцистеина ее нет.

    Пирролизин (Pyl), (O) встречается только у некоторых метаногенных архей, так что в нашем кишечнике его вполне можно найти. Чтобы не терять биохимической хватки:), выучим его формулу: к лизину через карбонил добавляем метилированный пиррол:

    Здесь надо запомнить, что название «пирролизин» может вводить в заблуждение, ведь пирролизин — это не просто «пиррол + лизин», а пиррол с двумя добавками: во-первых это метил, присоединенный к азоту, а во-вторых между метилированным пирролом и лизином встает карбонильная группа С=О.

    Теперь, когда мы в самых общих чертах рассмотрели разные РНК, можно коротко рассмотреть один важный вопрос. Наверное, было бы очень странным, если бы такой механизм, как эпигенетическое регулирование ДНК, не распространился бы в процессе эволюции и на РНК. Весь наш опыт изучения жизнедеятельности клетки показывает, что те или иные регуляционные механизмы существуют на очень и очень многих уровнях, что позволяет клетке очень быстро и очень чутко реагировать на изменившиеся условия внутри или вне клетки. Иногда эта система сдержек и противовесов просто поражает сложностью своей структуры: есть белки, которые могут быть деактивированы или форсированы другими белками, которые могут быть деактивированы или форсированы или приторможены третьими белками, которые… и т.д. И в самом деле, было обнаружено, что существуют механизмы эпигенетического регулирования РНК. Дисциплина, которая изучает это явление, называется эпитранскриптомикой, потому что этот процесс регулирования работает с транскриптами – слепками в виде РНК, построенных на матрице гена. Эпигенетическому регулированию подвергаются буквально все виды РНК: и матричные, и транспортные, и рибосомные, и микро и т.д.

    Мы можем запомнить существенную разницу: если метилирование происходит в ДНК, то метильная группа будет присоединена к цитозину, а в РНК метильная группа в 80% случаев будет присоединена к аденину (мнемоническое правило: «метилирование ДеЦентРАлизовано» — метилирование подвержены не только ДНК, но и РНК, т.е. этот процесс децентрализован, и пары букв ДЦ и РА указывают на то – какие именно основания метилируются в ДНК и в РНК).

    Еще одна важная разница заключается в том, что метилирование РНК встречается в десять раз чаще, чем метилирование ДНК! В принципе, в этом есть логика: хромосома – это и так уже очень сложный объект, поэтому нет смысла дополнительно его усложнять, если какую-то часть работы по управлению сиюминутной работой генома можно перенести на гораздо более простые и гораздо более доступные молекулы.

    Метилирование мРНК является способом блокировать активность гена, как и метилирование самого гена, но все-таки эти способы имеют некоторые различия, поэтому оба и используются клеткой в зависимости от обстоятельств.

    Например, есть вид метилирования мРНК, который найден буквально у всех: у млекопитающих, насекомых, растений, грибов, бактерий, вирусов… этот вид метилирования называется m6А (m – значит «метилирование», А – «аденин», 6 – номер атома в молекуле аденина). Таким метилированием занимается фермент с предсказуемым названием m6A-метилтрансфераза. Соответственно, есть и фермент, который, наоборот, снимает эту метильную группу. Другой пример метилирования мРНК, открытый совсем недавно, в 2016-м году, это m1А:

    Метилирование – далеко не единственный способ эпигенетического регулирования ДНК, и с РНК дело обстоит точно так же. Например, выяснилось, что цитозин в РНК тоже может быть субстратом для прикрепления к нему эпигенетических меток: к нему может присоединяться ацетильная группа (-СН3СО). Такая модификация цитозина в мРНК делает ее более стабильной, а возможно еще и облегчает ее контакты с аминоацил-тРНК. Запомним: «цитозин – ацетил».

    Итак, запомним два способа эпигенетического модифицирования РНК:
    а) метилирование аденина: m⁶А, m¹А
    б) ацетилирование цитозина.

    И в конце этой главы – биохимическая несложная разминка, точнее – заминка, раз речь идет о завершении изложения. Есть одна исключительно важная группа молекул – кетоны. Проще всего понять – что это такое, отталкиваясь от альдегидов. Если альдегид – это карбонил, углерод которого связан одной валентностью с водородом, а другой – с какой-либо органической группой (для альдегидов можно использовать такую форму линейной записи: RHC=O), то у кетонов обе валентности углерода заняты органическими группами (можно записывать как R2С=О). Это очень просто:

    Поскольку у альдегидной группы есть только одна свободная валентность, то она может находиться только на конце молекулы, и никак не в ее середине. Кетоновая группа может находиться и в центре. Мы уже разбирались в том, как устроены номенклатуры разных веществ, давай разберемся и в номенклатуре альдегидов, это совсем несложно (химическая номенклатура — совокупность названий индивидуальных химических веществ, их групп и классов, а также правила составления этих названий).

    Составляя название альдегида, мы указываем название соответствующего углеводорода, к которому добавляем суффикс «аль»  — нет ничего проще. Например, метаналь Н2С=О, этаналь Н3СС(Н)=О, пропаналь Н3ССН2С(Н)=О. Такие простые альдегиды имеют и тривиальные названия, т.е. упрощенные, исторически сложившиеся: соответственно это будет формальдегид, ацетальдегид (мы их уже знаем) и кротоновый альдегид:

    Кротоновый альдегид похож на изогнувшегося крота, копающего нору:

    МП: «крот зарылся в землю и пропал».

    Но есть и намного более сложно устроенные альдегиды, и в таких случаях мы нумеруем углеродную цепь, начиная с карбонильного углерода, а затем с помощью числовых индексов указываем положение различных дополнительных функциональных групп:

    Если в каком-то месте альдегида имеется двойная связь между углеродами, это тоже отражается в его названии, и суффикс «-ан» меняется на «-ен»: